Olio puro di Saposhnikovia divaricata per la produzione di candele e saponi, olio essenziale per diffusori all'ingrosso nuovo per diffusori con bruciatore a lamella

breve descrizione:

2.1. Preparazione dell'SDE

I rizomi di SD sono stati acquistati come erba essiccata dalla Hanherb Co. (Guri, Corea). I materiali vegetali sono stati confermati tassonomicamente dal Dr. Go-Ya Choi del Korea Institute of Oriental Medicine (KIOM). Un esemplare di buono (numero 2014 SDE-6) è stato depositato nell'erbario coreano delle risorse erboristiche standard. I rizomi essiccati di SD (320 g) sono stati estratti due volte con etanolo al 70% (con un riflusso di 2 ore) e l'estratto è stato quindi concentrato sotto pressione ridotta. Il decotto è stato filtrato, liofilizzato e conservato a 4°C. La resa dell'estratto secco dai materiali di partenza grezzi era del 48,13% (p/p).

2.2. Analisi quantitativa mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

L'analisi cromatografica è stata eseguita con un sistema HPLC (Waters Co., Milford, MA, USA) e un rilevatore a serie di fotodiodi. Per l'analisi HPLC dell'SDE, il prim-O-lo standard di glucosilcimifugina è stato acquistato dal Korea Promotion Institute for Traditional Medicine Industry (Gyeongsan, Corea) esec-O-glucosilhamaudol e 4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisamminolo sono stati isolati nel nostro laboratorio e identificati mediante analisi spettrali, principalmente mediante NMR e MS.

I campioni di SDE (0,1 mg) sono stati sciolti in etanolo al 70% (10 mL). La separazione cromatografica è stata eseguita con una colonna XSelec HSS T3 C18 (4,6 × 250 mm, 5μm, Waters Co., Milford, MA, USA). La fase mobile era costituita da acetonitrile (A) e acido acetico allo 0,1% in acqua (B) ad una portata di 1,0 ml/min. È stato utilizzato un programma con gradiente a più fasi come segue: 5% A (0 min), 5–20% A (0–10 min), 20% A (10–23 min) e 20–65% A (23–40 min) ). La lunghezza d'onda di rilevamento è stata scansionata a 210–400 nm e registrata a 254 nm. Il volume di iniezione era 10,0μL. Le soluzioni standard per la determinazione di tre cromoni sono state preparate ad una concentrazione finale di 7,781 mg/mL (prim-O-glucosilcimifugina), 31,125 mg/mL (4′-O-β-D-glucosil-5-O-metilvisamminolo) e 31,125 mg/ml (sec-O-glucosilhamaudol) in metanolo e conservato a 4°C.

2.3. Valutazione dell'attività antinfiammatoriaIn vitro

2.3.1. Coltura cellulare e trattamento dei campioni

Le cellule RAW 264,7 sono state ottenute dall'American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) e coltivate in terreno DMEM contenente l'1% di antibiotici e il 5,5% di FBS. Le cellule sono state incubate in atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37°C. Per stimolare le cellule, il mezzo è stato sostituito con mezzo DMEM fresco e lipopolisaccaride (LPS, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) a 1μg/mL sono stati aggiunti in presenza o in assenza di SDE (200 o 400μg/mL) per altre 24 ore.

2.3.2. Determinazione dell'ossido nitrico (NO), della prostaglandina E2 (PGE2), del fattore di necrosi tumoraleα(TNF-α) e produzione di interleuchina-6 (IL-6).

Le cellule sono state trattate con SDE e stimolate con LPS per 24 ore. La produzione di NO è stata analizzata misurando i nitriti utilizzando il reagente di Griess secondo uno studio precedente [12]. Secrezione delle citochine infiammatorie PGE2, TNF-αe IL-6 è stato determinato utilizzando un kit ELISA (sistemi di ricerca e sviluppo) secondo le istruzioni del produttore. Gli effetti dell'SDE sull'NO e sulla produzione di citochine sono stati determinati a 540 nm o 450 nm utilizzando un Wallac EnVision™lettore di micropiastre (PerkinElmer).

2.4. Valutazione dell'attività antiosteoartriticaNel vivo

2.4.1. Animali

Ratti maschi Sprague-Dawley (di 7 settimane) sono stati acquistati da Samtako Inc. (Osan, Corea) e alloggiati in condizioni controllate con un ciclo luce/buio di 12 ore a°C e% di umidità. Ai ratti è stata fornita una dieta da laboratorio e acquaad libitum. Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida del National Institutes of Health (NIH) e approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Daejeon (Daejeon, repubblica di Corea).

2.4.2. Induzione di OA con MIA nei ratti

Gli animali sono stati randomizzati e assegnati ai gruppi di trattamento prima dell'inizio dello studio (per gruppo). Soluzione MIA (3 mg/50μL di soluzione salina allo 0,9%) è stato iniettato direttamente nello spazio intrarticolare del ginocchio destro sotto anestesia indotta con una miscela di ketamina e xilazina. I ratti sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: (1) il gruppo con soluzione salina senza iniezione di MIA, (2) il gruppo MIA con iniezione di MIA, (3) il gruppo trattato con SDE (200 mg/kg) con iniezione di MIA e (4 ) il gruppo trattato con indometacina (IM-) (2 mg/kg) con iniezione MIA. Ai ratti è stato somministrato per via orale SDE e IM 1 settimana prima dell'iniezione MIA per 4 settimane. Il dosaggio di SDE e IM utilizzato in questo studio si basava su quelli impiegati in studi precedenti.10,13,14].

2.4.3. Misurazioni della distribuzione del peso delle zampe posteriori

Dopo l’induzione dell’OA, l’equilibrio originale nella capacità di carico delle zampe posteriori è stato interrotto. Per valutare i cambiamenti nella tolleranza al carico è stato utilizzato un tester di incapacità (strumentazione Linton, Norfolk, Regno Unito). I ratti sono stati posizionati con cura nella camera di misurazione. La forza di carico esercitata dall'arto posteriore è stata calcolata in media su un periodo di 3 s. Il rapporto di distribuzione del peso è stato calcolato mediante la seguente equazione: [peso sull'arto posteriore destro/(peso sull'arto posteriore destro + peso sull'arto posteriore sinistro)] × 100 [15].

2.4.4. Misurazioni dei livelli di citochine sieriche

I campioni di sangue sono stati centrifugati a 1.500 g per 10 minuti a 4°C; quindi il siero è stato raccolto e conservato a -70°C fino al momento dell'utilizzo. I livelli di IL-1β, IL-6, TNF-αe la PGE2 nel siero sono stati misurati utilizzando kit ELISA di R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) secondo le istruzioni del produttore.

2.4.5. Analisi RT-PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto dal tessuto dell'articolazione del ginocchio utilizzando il reagente TRI® (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), trascritto in modo inverso in cDNA e amplificato mediante PCR utilizzando un kit TM One Step RT PCR con SYBR green (Applied Biosystems , Grand Island, New York, Stati Uniti). La PCR quantitativa in tempo reale è stata eseguita utilizzando il sistema Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Grand Island, NY, USA). Le sequenze di primer e la sequenza sonda sono mostrate nella Tabella1. Aliquote di cDNA campione e una quantità uguale di cDNA GAPDH sono state amplificate con la miscela master TaqMan® Universal PCR contenente DNA polimerasi secondo le istruzioni del produttore (Applied Biosystems, Foster, CA, USA). Le condizioni della PCR erano 2 minuti a 50°C, 10 minuti a 94°C, 15 s a 95°C e 1 minuto a 60°C per 40 cicli. La concentrazione del gene bersaglio è stata determinata utilizzando il metodo comparativo Ct (numero di cicli di soglia al punto di incrocio tra il grafico di amplificazione e la soglia), secondo le istruzioni del produttore.

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L’osteoartrite (OA) è il disturbo muscoloscheletrico più frequente e la malattia articolare degenerativa più comune negli anziani.1]. L’OA è una condizione causata in parte da lesioni, perdita della struttura e della funzione della cartilagine e disregolazione delle vie proinfiammatorie e antinfiammatorie.2,3]. Colpisce principalmente la cartilagine articolare e l’osso subcondrale delle articolazioni sinoviali e provoca insufficienza articolare, portando a dolore durante il carico, compreso camminare e stare in piedi.4].

Non esiste una cura per l’OA, poiché è molto difficile ripristinare la cartilagine una volta distrutta.5]. Gli obiettivi del trattamento sono alleviare il dolore, mantenere o migliorare la mobilità articolare, aumentare la forza delle articolazioni e ridurre al minimo gli effetti invalidanti della malattia. I trattamenti farmacologici dell'OA mirano a ridurre il dolore al fine di aumentare la funzione articolare e la qualità della vita del paziente. Sebbene la distruzione della cartilagine sia l’evento principale nell’OA, la degradazione del collagene è l’evento fondamentale che determina la progressione irreversibile dell’OA in associazione all’infiammazione.6,7]. Si prevede che i trattamenti con attività antinfiammatoria e condroprotettiva allevieranno il dolore e manterranno l’integrità della matrice nei pazienti con OA.

Pertanto, la riduzione dell’infiammazione sarà probabilmente utile nella gestione dell’OA. Studi recenti suggeriscono un ruolo protettivo delle risorse erboristiche sulla progressione dell’OA, in termini di mitigazione dell’infiammazione dei condrociti e dell’ulteriore distruzione della cartilagine, attraverso la loro capacità di interagire con i tessuti associati alle articolazioni, con conseguente mitigazione del dolore articolare.8].

La radice diSaposhnikovia divaricataSchischkin (Umbelliferae) è stato ampiamente utilizzato nella medicina tradizionale per il trattamento di mal di testa, dolore, infiammazione e artrite in Corea e Cina.9,10]. I diversi effetti farmacologici diSaposhnikovia divaricata(SD) includono anche proprietà antinfiammatorie, analgesiche, antipiretiche e antiartritiche.9,11]. Uno studio recente ha dimostrato che l’estratto del cromone SD possiede potenziali effetti antireumatoidi sull’artrite in un modello murino di artrite indotta dal collagene.10]; tuttavia, sono stati condotti pochi studi per supportare l’attività antinfiammatoria e antiartritica delSaposhnikovia divaricataestratto (SDE).

Pertanto, il presente studio ha studiato le attività antinfiammatorie e antiartrosi di un estratto di SD con etanolo al 70%. Innanzitutto è stato valutato l’effetto antinfiammatorio dell’SDEin vitronelle cellule RAW 264.7 indotte da LPS. Successivamente, l’effetto antiartrosico dell’SDE è stato misurato valutando la distribuzione del carico, la degradazione della cartilagine articolare e le risposte infiammatorie in un modello di ratto di OA indotta da iodoacetato monosodico (MIA).